近年凯丰资本，液体生物制品制剂配方和稳定性取得了较多进展。本文全面总结了蛋白质药物在化学和物理层面上的不稳定性问题，并探讨相应的解决策略。在化学不稳定性方面，本文详细讨论脱酰胺、异构化、糖基化、二硫键还原、蛋白水解和氧化反应等主要降解途径，并提出了相应的预防和控制措施。在物理不稳定性方面，涵盖变性、错误折叠、聚集体形成、液-液相分离、乳光以及界面相互作用引起的问题。此外，本文还介绍化学和物理不稳定性之间的相互作用，以及这些因素对蛋白质药物配方策略的影响，特别是高浓度蛋白质制剂的开发。通过深入理解这些不稳定性问题，可以提高蛋白质药物的稳定性、有效性和安全性，从而推动其在临床方面的应用。
PART.01 化学不稳定性问题1．脱酰胺
最广泛观察到的化学降解途径是脱酰胺，尤其是Asn残基的脱酰胺，其次还有Gln及mAb脱酰胺。主要的脱酰胺机制涉及通过环状酰亚胺中间体进行分子内环化，然后环打开形成Asp或异Asp残基，如图1。其速率影响因素主要是pH、缓冲液、空间体积以及侧链间氢键的形成。
措施：使用偏酸性pH缓冲体系、使用满足需求的最小缓冲浓度（避免缓冲催化）、设计和选择蛋白质底物时考虑避免使用易发生脱酰胺反应的序列（如Asn-Gly、Asn-Ser、Asp-Gly）、消除或减少成品中的氧气、避光、降低储存温度、探索新型辅料等。
展开剩余93%图1sn残 A基脱酰胺化
2．异构化
异构化（Asp-异Asp相互转化）涉及环化反应生成琥珀酰亚胺中间体，与脱酰胺反应非常相似，如图2。Asp异构化速度与pH值有关，碱性条件下较快。存在甘油时，盐（尤其是镁盐）的稳定作用被放大，大大减缓了异构化。Asp异构化在mAb中频繁发生，其中CDR中的异构化可能对活性和效力产生不利影响。Asp残基的降解机制受多种因素的影响，包括 pH值、缓冲液性质、离子强度、共溶剂等。
措施：常取决于分子结构，可通过基因编辑技术如CRISPR-Cas9、RNA剪切调控、设计小分子药物或抗体调节特定异构体的活性、siRNA、ASOs或PROTACs耗竭特定的蛋白质异构体来减少异构体的影响；也可通过使用保护剂如抗氧化剂、防腐剂，添加稳定剂如糖类、盐类提高蛋白质的稳定性来减少异构化的发生。
图2 异构化
3．糖基化
影响治疗性蛋白质的最常见缩合反应类型是碱性基团（如 Lys 的侧链）与还原糖之间的反应，该过程称为美拉德反应（图3），文献中也称为糖基化或非酶褐变。因此，通常避免在使用还原糖的同时将蛋白质配制成液体。例如，在果糖或麦芽糖存在下储存依那西普会导致蛋白质糖化。研究表明在pH 2-6之间，糖基化程度随着pH增大而增加，一旦pH超过8时，糖基化程度就会降低。值得注意的是，蔗糖在酸性或较高温度下，易水解形成葡萄糖和果糖，这两者都是还原糖。有证据表明，高温储存的蔗糖基蛋白质制剂中确实会发生糖化。在类似条件下，海藻糖的水解速度似乎比蔗糖慢200到2000倍，因此不太可能参与糖化。
措施：酶法去糖基化如内切或外切糖苷酶、化学法去糖基化如肼或三氟乙酸、基因编辑技术如CRISPR-Cas9、小分子抑制剂抑制糖基化酶、调节糖基化途径等。
图3 蛋白质糖基化
4. 二硫键还原
二硫键还原是指将蛋白质分子中的二硫键（S-S键）还原为巯基（-SH）的过程，半胱氨酸是唯一一个可以形成二硫键的氨基酸。二硫键能降低蛋白质在未折叠状态下的构象熵，维持分子与分子之间和分子与溶液之间的热力学效应， 从而有效地维持稳定的蛋白质三维结构。因此二硫键不仅是一种翻译后修饰类型， 更是保证蛋白活性构象的首要条件。图4为四种抗体类型二硫键的链接方式。其影响因素主要为细胞收获时的剪切力、溶氧、pH、温度、细胞内氧化还原状态等。
措施：添加EDTA、金属离子等抑制相关还原酶的活性、提高溶氧、减少细胞收获时的剪切力、调节溶液的pH、降低储存温度延缓二硫键的还原。
图4 四种抗体类型二硫键的链接方式
5．蛋白水解
多肽链可以被多种被称为蛋白酶的酶切割。然而，它们还可以进行非酶水解，这一过程称为蛋白水解，如图5。
图5 蛋白水解
多肽链可通过蛋白酶切割或非酶水解（蛋白水解）发生断裂。一般肽键在中性pH下的半衰期很长，但某些序列如Asp、Gln、Glu、Ser和Thr残基更易发生水解，主要是由于分子内环化过程，如图6。金属离子可催化这些反应。mAb的铰链区也易发生水解，该反应的序列依赖性较低，可由金属催化或自由基引发，且受pH影响，在酸性和碱性条件下均更快。不同IgG亚型在铰链区碎片化程度上存在差异，IgG1较易发生，可能与其灵活性增加有关。
措施：通过优化蛋白质的配方和环境条件，例如调整pH值，添加缓冲剂等，还可以通过使用蛋白质修饰技术，例如聚乙二醇化，分子交联等。
6．氧化反应
主要的氧化机制包括金属催化氧化（MCO）以及羰基化，可导致氨基酸侧链和肽主链的化学修饰。MCO需要具有氧化还原活性的金属如铜、铁、锰参与，可导致His、Met、Trp和Tyr等残基的修饰。其中Met最易被氧化，形成相应的亚砜（图7）；Trp次之。Trp氧化后形成多种降解产物，甚至导致颜色变化。羰基化是多肽主链的氧化，以及赖氨酸、精氨酸、苏氨酸和脯氨酸等氨基酸侧链被脂肪酸的MCO衍生的活性醛转化而成的过程，可能影响蛋白质的稳定性和免疫原性。
措施：可通过减少与反应性氧化物物质的直接接触、添加自由基清除剂、牺牲添加剂、螯合剂来限制氧化反应，避光、降低储存温度等。
图7 Met氧化
7．化学不稳定性的预测方法
过去十年，化学不稳定性预测取得了重大进展，尤其是在机器学习算法的应用方面。这些新兴的计算预测方法包括对翻译后修饰、脱酰胺、氧化、羰基化、羟基化和糖基化等的预测，为评估和改善蛋白质药物的化学稳定性提供了强大的工具，有助于发现新的蛋白质药物候选物的同时，还可用于优化现有治疗性蛋白质的稳定性和活性。
PART.02 物理不稳定性问题物理不稳定性是指导致蛋白质形式改变而不影响共价键（即没有共价键断裂或形成）的任何过程。
1．变性
蛋白质的变性通常与高级结构（HOS）的部分或完全丧失有关，涉及二级和三级结构元素的干扰，包括化学变性、热变性以及冷变性。
①诱导化学变性的主要方法是添加变性剂（离液剂）如尿素和盐酸胍（GnHCl）。变性剂还可以改变蛋白质内可电离基团的pKa值。②除了化学变性，温度升高也可以引起蛋白质的变性。热变性通常呈S形，Tm值常用作构象稳定性的替代指标。在较低pH下，mAb的热变性表现出高度可逆性。③此外，蛋白质还存在冷变性现象。温度与自由能的关系图呈抛物线形如图8，高温截距对应于上面讨论的 Tm值，低温截距称为冷变性温度。构象稳定剂和pH变化都会影响冷变性温度。
2．形成稳定的错误折叠
蛋白质的天然构象（native conformation）通常是其能量最低的状态凯丰资本，但在外界条件干扰下，动力学过程可能引导蛋白质折叠到非天然状态，例如，高温、极端pH、机械剪切力可能使蛋白质从天然态转变为错误折叠态。错误折叠导致蛋白质失去其功能性三维结构，从而丧失活性，还可能触发分子间相互作用，导致形成不溶性聚集体，同时可能被免疫系统识别为异物，从而诱发免疫反应。
措施：错误折叠需要在细胞水平解决，例如通过基因工程技术优化序列，增加蛋白质的折叠稳定性和抗聚集能力。
3．聚集体和颗粒的形成
聚集体分为非共价及共价聚集体。非共价聚集体的聚集过程包括成核和生长两个阶段。其中关键核通常是寡聚物，对于mAb而言，关键核是二聚体或三聚体。通过调节pH来提高构象稳定性和胶体稳定性对于减缓蛋白质聚集至关重要。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）也能调节聚集行为。共价聚集通常涉及分子间二硫键的形成，可通过降低pH、降低温度或去除/阻断游离半胱氨酸来减缓。
亚可见粒子可能具有潜在的免疫原性，需要加强对这些颗粒的检测、量化和表征。此外，对可见颗粒进行目视检查。
4．聚集诱导的结构性变化
聚集导致蛋白质丧失其天然构象，功能性位点被掩盖或失活，不溶性聚集体可能导致蛋白质药物的溶解度下降，影响其吸收和分布，同时，聚集体的形成可能引起药物制剂的不均一性，从而影响产品的质量控制和疗效。
措施：添加表面活性剂，如吐温20/80，减少界面吸附引起的聚集，还可以通过金属离子调控，添加螯合剂避免金属离子诱导的聚集。改善生产工艺，选择蛋白质在最稳定条件下进行生产和储存，减少机械应力对蛋白质的影响，去除已形成的聚集体，避免其作为聚集种子。
5．液-液相分离 (LLPS)
LLPS指水溶液分离成富含蛋白质的相和缺乏蛋白质的相的过程。在高浓度、存在聚合物添加剂或发生相变的情况下，LLPS会加剧。可通过PPI、调节pH或使用某些赋形剂来调节LLPS。构象变化也与mAb产生的LLPS有关。LLPS不仅本身是一种物理不稳定性，也在某些蛋白质的聚集中发挥作用，还会干扰mAbs的纯化。仅靠浊度测量可能无法准确估计LLPS，因为可能发生液体到固体的现象，形成大颗粒。
措施：为防止蛋白质药物因溶质间相互作用引发液-液相分离，应通过优化溶液条件（如pH、离子强度、温度）、添加保护剂（如糖类、多元醇、表面活性剂）、降低蛋白质浓度以及改良储存和工艺条件来稳定体系。此外，可采用分子工程手段优化蛋白质结构，结合实时监测技术分析溶液均匀性，以确保制剂的长期稳定性和均一性。
6．乳光
在mAb溶液中经常见到乳光，尤其是在较高浓度时。这种溶液行为与蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质瞬时网络的形成有关。乳光行为依赖于温度，在较低温度下更为明显。离子辅料（如NaCl和氨基酸，尤其是ArgHCl）可以调节mAb溶液中的乳光程度。较低的离子强度有助于减少乳光。pH和缓冲液对mAb乳光也有影响。此外，去除聚山梨酯也可增加IgG1 mAb的乳光度。
7．界面相互作用引起的不稳定性
1）气液界面不稳定性
蛋白质溶液在整个生产过程中以及在最终容器中都会遇到空气-水界面，这可能导致界面损伤。为了评估这种损伤，通常会进行搅拌研究。虽然去除顶部空间可以防止这种损伤，但很难实施。因此，添加表面活性剂几乎总是有益的。表面活性剂可以在界面上胜过蛋白质，从而阻止蛋白质进入可能引起界面应力的表面。
pH和盐浓度也会影响界面稳定性。pH可通过改变蛋白质的二级结构和整体电荷来控制空气-水界面吸附和聚集作用。由于空气-水界面带负电荷，盐也可以在搅拌过程中调节损伤。
2）运输引起的损坏和机械冲击
冲击引起的损伤已成为评估蛋白质制剂的另一个因素，表面活性剂在减少因掉落和机械冲击引起的颗粒形成方面非常有效。
3）胶体和构象稳定性在控制界面损伤中的作用
研究表明，改善胶体稳定性可减缓或抑制由界面应力（如搅拌过程中）引起的聚集，构象稳定性也被认为在调节界面损伤方面发挥作用。在这两者中，胶体稳定性可能更具影响力。
PART.03 物理稳定性的预测方法1．聚集倾向
目前，已有多种算法被广泛应用于根据蛋白质序列预测其聚集倾向。最广泛使用的预测方案之一是空间聚集倾向 （SAP）法，该方法根据疏水基团的动态暴露来识别热点，主要应用于研究mAb的聚集行为。对抗体的PPI进行建模可预测其胶体行为，有助于理解PPI如何调控聚集。构象稳定性和胶体稳定性的组合也被用于预测聚集速率，特别是针对mAb。
2．溶解度预测
在过去的几十年中，人们使用了各种方法来估计或衡量蛋白质的溶解度（相对或绝对），目前已出现了更复杂的溶解度预测算法，例如SolPro、PROSO、CCSOL、CamSol等。
3．LLPS预测
可基于π-π型相互作用的形成来预测蛋白质对 LLPS 的倾向。
4．粘度预测
由于粘度与胶体稳定性密切相关，将第二渗透维里系数（B22）或相互作用参数（kD）作为表征PPI的预测工具。研究发现，B22似乎比kD更能预测粘度，但kD也被报道为跨制剂粘度行为的有效预测因子。在根据低浓度下测得的粘度进行推测时，哈金斯系数（kH）的属性比kD或B22更有效。
PART.04 化学和物理不稳定性之间的相互作用
虽然人们可以根据机制原理区分化学和物理不稳定性，但事实上，化学降解会导致构象稳定性或聚集倾向的变化，聚集体的形成或球状结构的改变会导致化学降解加速（如图9）。
图9 化学和物理不稳定性的相互作用
1．脱酰胺和聚集
在多数情况下，脱酰胺会增加蛋白质的聚集倾向。但也有例外情况，对于淀粉样变性肽IAPP，Asn21处的脱酰胺反而可减慢聚集，而N14D突变体则会加速纤维形成。这种差异可能源于脱酰胺对蛋白质构象稳定性、胶体稳定性以及柔韧性等的不同影响。脱酰胺可通过增加蛋白质的构象稳定性来促进聚集，如细菌酶MurA中isoAsp的形成；但它也可能降低胶体稳定性，从而加速聚集。
脱酰胺还可加速干扰素-α的聚集，但不如Met氧化所致的聚集那么严重。
2．氧化和聚集
氧化是一种广泛变化的化学降解过程，已发现其会影响蛋白质的物理稳定性，特别是在改变聚集倾向方面。降钙素、松弛素肽片段、延胡索酸酶等蛋白质在遭受氧化后，其聚集倾向均有所增加。此外，Met残基的氧化、mAb的金属催化氧化、羰基化、光氧化均会导致聚集形成。可通过添加螯合剂或游离Met来减少氧化损失。
3．糖化和聚集
大量研究表明，糖化可以增加HSA、BSA、IgG、抗体轻链等的聚集倾向。这可能是由于糖化改变了蛋白质的表面性质，降低了其胶体稳定性，从而促进自缔合和聚集。但另一方面，糖化也可以通过增加构象或热稳定性来抑制蛋白质的聚集。
确切的聚集行为（有利或不利）似乎取决于还原糖的类型。对 Aβ 肽中纤维形成的影响还取决于糖化的确切位点。
4．其他
此外，还有pGlu的形成和聚集、Asp异构化和聚集、碎片/截断和聚合等化学和物理不稳定性之间的相互作用。
PART.05 上述所有内容如何影响（联合）配方策略配方策略主要包括: ①剂型（液体、冻干等）②辅料（包括pH）③确定合适的蛋白质浓度和工艺④选择适当的包装和储存条件。以下论述中，我们将研究如何选择辅料来维持稳定性和其他重要的产品性质（粘度、溶解度、外观等）。
1．辅料选择
（1）辅料质量/纯度：辅料的质量和纯度会影响蛋白质治疗剂的稳定性。此外，辅料本身，尤其是质量差或含有某些杂质的辅料，也会导致患者中毒和不良反应。
（2）新型/未来辅料：新型稳定剂的开发是一个重要研究方向，如氨基酸衍生物等。
（3）非离子型表面活性剂：聚山梨酯是最常用的表面活性剂，但易受水解和氧化损伤，导致游离脂肪酸释放和颗粒形成。唯一得到广泛评估的聚山梨酯替代品是泊洛沙姆188，其他潜在替代品有：n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）、Brij-58、FM1000。
2．辅料对稳定性的影响
（1）化学稳定性：①影响脱酰胺：包括胺、多元醇、糖基聚合物、氨基酸、盐、多胺和氨基酸衍生物②控制氧化：包括抗氧化剂、牺牲添加剂和螯合剂③抑制糖化：包括抗氧化剂，如白藜芦醇、皂苷和多酚。
（2）构象稳定性：辅料可通过排除溶质效应和配体结合机制影响蛋白质的构象稳定性。
①排除溶质效应：依赖于pH，发生在任何优先在本体中以高于蛋白质表面浓度的溶质中，包括糖、多元醇、大多数氨基酸、某些盐和大多数聚合物。可通过增加排除溶质的量来改善构象稳定性。分子量较高的物质似乎更能起到稳定的效果。
②配体结合：小分子与天然状态的蛋白质结合的能力是实现构象稳定性提高的另一种通用方法的基础。可通过配体结合提供增强构象稳定性的辅料范围很广，包括金属、表面活性剂、阴离子、环糊精、核苷酸、脂肪酸、维生素、辅因子、聚阴离子和聚阳离子。
（3）胶体稳定性：调节PPI的能力即改善胶体稳定性的能力，可以提高溶解度、减缓聚集、减轻乳白色并降低粘度。改善胶体稳定性的辅料包括氨基酸，尤其是精氨酸盐。
3．多剂量配方
多剂量产品需使用防腐剂来抑制微生物生长，同时要考虑防腐剂对蛋白质稳定性的影响。
PART.06 高浓度蛋白质的配方
目前，开发主要用于皮下给药的高浓度（HC）蛋白质制剂已成为研究热点。然而，HC制剂开发面临诸多挑战，如高浓度下蛋白质溶液的高粘度及易聚集特性。
1． 皮下注射问题
与静脉输注相比，皮下给药的生物利用度降低。对于mAb，生物利用度可能低至50 %。与大分子药物成分相比，分子量较低的辅料会快速分散。较大的药物成分会进入淋巴系统，这占了与生物利用度降低相关的大部分损失。且可能会出现注射部位反应，包括注射时疼痛。
2． 粘度调节
随着蛋白质浓度的增加，粘度呈指数增加。通过添加适当的辅料可以降低高浓度蛋白质溶液的粘度，如Pro、Gly、盐（包括NaCl）、碱性氨基酸 (His、Lys、Arg) 、Arg-Glu和糖，包括核苷酸在内的大分子极性和离子化合物。NaCl或ArgHCl等离子化合物并不总能有效降低粘度。咖啡因和ArgHCl等辅料的组合可能是降低粘度的更有效策略。
3． 稳定性问题
随着蛋白质浓度的增加，聚集倾向往往会更大。NaCl、Arg、Pro都能有效控制聚集并降低粘度等。离子强度增加通常会导致胶体稳定性降低，从而在较高浓度下加速聚集。
4． 替代品
若希望达到高于250 mg/ml的浓度，可能需要HC液体制剂的替代品。替代品可分为两类：替代剂型和替代药物输送方法。
（1）剂型：悬浮液（水悬浮液、油中固体悬浮液、非水溶剂）、纳米簇分散体
（2）药物输送方法：聚电解质与蛋白质形成复合物、络合法
已经提出了各种其他替代剂型和配方策略，包括致密相、凝聚物、蛋白质颗粒和蛋白质晶体。开发高浓度制剂的驱动力之一是皮下注射的体积限制，使用重组透明质酸酶 （rPH20）会暂时破坏基底膜，从而允许皮下注射更大量的药物 (最多20 mL)。这些方法为实现更高的蛋白质浓度、更高的稳定性或更低的粘度提供了其他选择。
5． 复合配方
越来越多地致力于开发在单一溶液中含有多种蛋白质的蛋白质疗法。蛋白质（尤其是mAb）联合配制受到了更多关注。虽然看起来大多数mAb混合物几乎没有相互作用，但必须始终注意带相反电荷的蛋白质引起的问题，这种混合物可能具有胶体不稳定性。两种不同的 mAb共同配制会导致稳定性较差的物种变得稳定，而较稳定的蛋白质变得不稳定。
参考文献
[1] Manning MC, Holcomb RE, Payne RW, Stillahn JM, Connolly BD, Katayama DS, Liu H, Matsuura JE凯丰资本, Murphy BM, Henry CS, Crommelin DJA. Stability of Protein Pharmaceuticals: Recent Advances. Pharm Res. 2024 Jul;41(7):1301-1367. doi: 10.1007/s11095-024-03726-x. Epub 2024 Jun 27. PMID: 38937372.
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